IgEの第三の受容体とアトピー(2)

今日は、昨日の続きじゃ。

 

 

 

 

 

 

●2回目

ガレクチン-3はアトピー性皮膚炎のマウスモデルにおいてアレルギー性炎症反応の発現に非常に重要である

Jun Saegusa、Daniel K. Hsu、Huan-YuanChen、Lan Yu、Agnes Fermin、Maxwell A.Fung、Fu-Tong Liu

カリフォルニア大学デービス校 皮膚科(サクラメント、カリフォルニア)

 

<材料と方法>

動物

(省略)

感作プロトコール

(省略)

 
OVA特異的T細胞の養子移植

(省略)

 
<病理組織>

 

ヒト組織

皮膚生検は施設で承認されたガイドラインにしたがって、5人のAD患者とADその他の明らかな皮膚疾患をもたない2人のボランティアで行った。AD患者は病変部位および非病変部位で行った。採取した組織はパラフィン包埋切片あるいはoptimal cutting temperature compound/最適切削温度化合物(Sakura Finetek, Torrance, CA)包埋によって凍結切片を作製した。凍結切片は切離直後に95%エタノールに固定し、免疫標識前に再度新鮮パラホルムアルデヒドに2分間固定した。5μmの切片はヤギ抗体23あるいは抗CD4抗体(clone 1F6 AbD Serotec, Raleigh, NC)をガレクチン-3検出用にメーカーの指示にしたがって用いた。それはペルオキシダーゼ-conjugated 2次抗体とジアミノベンジジンを用いて開発されたものである。二重染色はCD4抗体とalkaline phosphatase UltraVision LP Detection System(Labvision, Fremont, CA)を用い、fast red substrate、ビオチン化ヤギ抗ガレクチン-3を加えて行った。さらにストレプトアビジンHRP(streptavidin-horseradish peroxidase)(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)とdiaminobenzidine/Ni(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を用いてメーカーの推奨にしたがってフォローした。コントロール 1次抗体、二重染色に用いた環境では反応は観察されなかった。Unmatched second reagentでは、染色は観察されなかった(非表示)。顕微鏡写真はOlympus IX81 顕微鏡に対物レンズ ×10(NA 0.3)、×60(NA 1.42)を取り付け、DP7lカメラで撮影した。
 

マウス組織

皮膚標本は皮膚パッチを剥離して24時間後のOVA処理部位から採取した。標本はドライアイス上でoptimal cutting temperature compound/最適切削温度化合物(Sakura Finetek, Torrance, CA)で包埋した。Multiple 4-μmの切片を作製した。表皮肥厚は各スライドのランダムに選んだ最低10箇所の平均から求めた。細胞は20箇所の強拡大視野(×1000)でblind fashionで数えた。各サンプルの強拡大視野における細胞数の平均を示した。
切片は免疫組織化学的分析用にも作製した。ガレクチン-3を免疫ペルオキシダーゼ染色するために、サンプルは抗ガレクチン-3モノクローナル抗体A3A12 24を添加して既報23の通りインキュベートした。結合した抗体はメーカーの指示(DakoCytomaation, Inc. Carpinteria, CA)にしたがって、アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ法によって検出した。CD4とガレクチン-3を二重免疫蛍光染色するために、提示された凍結切片のプロトコールにしたがって抗CD4モノクローナル抗体(clone GK1.5, eBioscience, San Diego, CA)を用いた。さらにAlexa488-conjugated 2次抗体(Invitrogen, Carlsbad, CA)でフォローした。ガレクチン-3に対してはヤギ抗体を使用した。続いてrhodamine-conjugated 2次抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)でフォローした。

 

血清IgE, IgG1, IgG2aの定量

(省略)
 

In vitroにおけるサイトカイン合成の分析

脾臓と流入領域(腋窩)リンパ節細胞の単細胞懸濁液には10%牛胎児血清含有RPMI 1640を用いた。細胞は24 wellプレートでOVA(50μg/mL)存在下、4×106 cells/mLの培養液上部で培養した。72時間後、上清を採取し サンドイッチELISA法によって、メーカーの指示にしたがってサイトカインを分析した(IL-4, IFN-γ, IL-5, eBiosciences, San Diego, CA; IL-12, BD Pharmingen, San Diego, CA)。
 

RNA標本、cDNA合成、リアルタイムPCR

(省略)
 

骨髄由来樹状細胞

(省略)

 

OVA特異的TCR tgマウス由来T細胞からのサイトカイン分泌

OVA特異的TCR tgマウスの脾臓から採取したCD4+T細胞は上記の方法で精製した。gal3-/-とgal3+/+樹状細胞はOVA323-339ペプチド(10μg/mL)で3時間刺激した。OVA刺激した樹状細胞を採取し、洗浄後、OVA TCR tgマウス由来の精製ナイーブT細胞と混合し、10%牛胎児血清と50μmol/L 2-mercaptoethanol含有RPMIに懸濁した。樹状細胞(2×104)とT細胞(2×105)は72時間共培養した。増殖したT細胞(5×105)はプレートに結合した抗CD3(10μg/mL)+抗CD28抗体(20μg/mL)でさらに48時間再刺激した。刺激前後に上清を採取し、IFN-γとIL-4を評価した。

統計学的分析

統計学的分析はsoftware GraphPad Prism ver 4を用いてStudentのt検定で行った。P値は<0.05を有意とした。

 

以上じゃ。続きは明日じゃ。

 
おまけ★★★★博士のつぶやき

今日の内容は、論文の実験の方法について述べており、一般の人にはあまり関係ない内容じゃと思うが、論文そのものを読み解きたい人にとっては重要な部分のため、一部を省略して掲載した。
明日は、結果について述べたいと思う。